固相合成以树脂为载体,常用树脂有二氯树脂,AM树脂,wang树脂等。将首个氨基酸的羧基与树脂上的活性位点结合,然后脱除主链氨基上的fmoc 保护基团,再将下一个氨基酸的羧基与首个氨基酸的游离氨基脱水缩合形成酰胺键。重复以后步骤直至接完所有的氨基酸。最后用切割液把多肽从树脂上 切割分离出来。
树脂的溶胀 》称取树脂放入反应柱里,然后在反应柱里加入DCM,振荡30min,活化待用。
连接首个氨基酸 》通过沙芯抽滤掉DCM溶剂加入首个氨基酸,再加入10倍树脂摩尔量的DIEA最后加入少量的DMF溶解振荡1h。反应完后用DMF和DCM交替清洗6遍。
脱保护 》加入20%哌啶/DMF溶液,5min后抽掉。再加入20%哌啶/DMF溶液,振荡15min。
检测 》抽掉哌啶溶液,取十几粒树脂用乙醇洗三次,加入茚三酮,吡啶,苯酚各一滴,105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应可以继续接下一个氨基酸,如果不变色则为阴性,需要重新脱保护。
首次清洗 》依次用 DMF、甲醇、DMF分别清洗两次。
缩合 》加入保护氨基酸,缩合剂HBTU,用少量的DMF溶解,立刻加入DIEA,反应30min。
第二次清洗 》依次用 DMF、甲醇、DMF分别清洗两次。
检测 》抽掉溶剂取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入茚三酮,吡啶,苯酚各一滴105℃-110℃加热5min,无色为阳性反应若为蓝色则需要重新缩合。
肽链的延伸 》按照以上方法重复操作,依次接完剩余的氨基酸。
肽链的收缩 》等最后一个氨基酸接好以后整条肽的合成就反应完成了。进入最后的收缩阶段,用DMF洗涤反应3遍,DCM洗涤反应3遍,甲醇洗涤反应3遍,最后抽干肽树脂即可。
氨基酸侧链脱保护与树脂的切割 》配置切割液15ml,其中各组分的体积比为:TFA(94.5%)、水(2%)、EDT(2.5%)、TIS(1%)。将树脂装入烧瓶中恒温 (30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干,然后倒入离心管中,缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min,倒 掉上清液,下方为白色固体。再用乙醚洗6次然后常温挥干,即得粗品肽。